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Lösungen Kapitel 30

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Aufgabe 30.1:

Zur Entstehung des Pyruvats.

Pyruvat (Struktur siehe Abb. 1a und Kapitel 30.1 und 30.A.1.) ist das (wasserstoffarme) Endprodukt der Glykolyse und entsteht z. B. durch Abbau der (wasserstoffreichen) Glukose (s. Schema 30.2).

Abb. 1 Links: Struktur des Pyruvats. Rechts Umwandlung von Glukose in Pyruvat.

Erinnerung an die Glykolyse [1]: Die Glykolyse ist ein universeller Weg zur Energieerzeugung ohne OLaTeX: _2 in allen Zellen. In Erythrozyten ist sie der zentrale Weg zur Energieerzeugung. Im Muskel liefert dieser metabolische Prozess schnell Energie in Form von ATP. Der Abbau der Glukose erfolgt in einer Kaskade enzymatischer Reaktionen, wobei insgesamt zwei Moleküle ATP und zwei Pyruvatmoleküle entstehen [1]. Der Prozess besteht aus drei Schritten (s. Schema):

1. Die Umwandlung von Glukose in Fruktose-1,6 Biphosphat (F-1,6-BP). Bei diesem Schritt wird das Molekül vierfach negativ geladen und kann nicht mehr durch Membranen diffundieren. Außerdem wir es destabilisiert, was die weiteren Reaktionen erleichtert.

2. Spaltung der F-1,6-BP (mit 6 C-Atomen) in zwei C3-Fragmente, die durch Isomerisierung leicht ineinander umgewandelt werden können, und zwar durch das Enzym Triosephosphat Isomerase.

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3. Oxidation der C3- Fragmente in Pyruvat, wobei zwei ATP entstehen. An der Glykolyse sind insgesamt 10 Enzyme beteiligt, deren Funktion im folgenden Schema dargestellt sind. Eine übersichtliche Darstellung der Strukturformeln findet man in [1]Kapitel 16, Abb. 16.3.

Abb.2: Reaktionsfolge der Glykolyse in vereinfachter Darstellung. An der Enzymkaskade sind 10 Enzyme beteiligt. In der ersten Phase fungiert ATP als Substrat. Es kann aber auch als Inhibitor fungieren und so die Überproduktion von ATP verhindern. Der Einsatz oben zeigt das zeitliche Verhalten des Absorptionsspektrum eines Extrakts aus Hefezellen bei 355-395 nm. Es ensteht bei ständigem Rühren des Extrakts. Der untere Einsatz zeigt ein raum-zeitliches Muster der Verteilung des NADP+, das sich dann ausbildet, wenn nicht gerührt wird.

Zur Beobachtung der Glykolyse-Aktivität mittels Fluoreszenz-Spektroskopie [2]

Zur Bestimmung der Effektivität der Glykolyse (z.B. als Funktion der ATP-Konzentration) benutzt man die Fluoreszenz- oder Absorptionsspektroskopie. Im Fall der Glykolyse beobachtet man die Fluoreszenz (oder Absorption) des NADH. NADH absorbiert Licht mit Wellenlängen von 300 - 380 nm, während NAD+ und die überwiegende Mehrheit aller Proteine erst unterhalb von 300 nm nennenswert Licht absorbieren.

Abb. 5.8a zeigt die Absorption des NADH in einem Extrakt aus Hefezellen [2]. Überraschenderweise beobachtet man eine periodisch variierende Absorption. In anderen Worten: die Glykolyse in der Hefe erfolgt periodisch. Die Periode von 4.5 min ist eine intrinsische Eigenschaft der Zellen. Die Glykolyse ist daher ein mögliches Modell einer biologischen Uhr. Zeitliche Oszillationen beobachtet man bei ständigem Durchmischen des Hefe-Extraktes. Wenn dies unterbleibt, so wird die Reaktion von der Diffusion der Substanzen abhängig. Dies führt zur Ausbildung raum-zeitlicher Muster der NAD+ Verteilung. Die Glykolyse ist daher auch ein interessantes Beispiel für die raum-zeitliche Strukturbildung in der Biologie [1].

Referenzen:

1 Berg J. et al. Biochemie Spektrum Verlag Berlin 2003

2 Hess, B. und Boiteux, A., (1971) Annual Review Biochemistry 40 237 ff

Aufgabe 30.2:

Der Protonen- und Elektronen-Umsatz bei organischen Reaktionen.

Die Aufgabe dient dazu, sich mit dem Umsatz von Elektronen und Protonen bei photobiologischen Prozessen vertraut zu machen.

Die Dunkelreaktion wird durch die pauschale Reaktion beschrieben. Es dürfen keine freien LaTeX: H^+ oder LaTeX: e^- übrig bleiben.

Teilaufgabe A: Abbildung 1 zeigt die Aufteilung der Dunkelreaktion (die Bildung der Glukose)in einzelne Unterreaktionen.

30 2 neu.png

Die Bilanz: Von den durch die Wasserspaltung freigesetzten 12 Elektronen und Protonen dienen 5 Paare zur Bildung von OH Seitengruppen der Glukose. Das sechste Paar dient zur Bildung der Endgruppe -C-C (H)=O.

Aufgabe 30.3:

Beweis der Kopplung zwischen der Rotation der LaTeX: F_1-LaTeX: F_0-Proteinkomplexe und der ATP-Synthese bzw Hydrolyse

Es wird empfohlen vor der Bearbeitung der Aufgabe Kapitel 30.7 zu lesen und sich die Struktur und Funktion der ATP-Synthase einzuprägen. Ein molekularer Mechanismus der ATP-Synthase wurde erstmals in den 1980er Jahren durch P. Boyer vorgeschlagen und das Modell wurde mittels Röntgenstrukturanalyse durch die Gruppe von J. E. Walker teilweise bestätigt. Es gab auch einige direkte Hinweise, dass die ATP-Synthese auf der gegenseitigen Rotation der F1 und F0 Komplexe beruht [1], [4]. In einem berühmten Experiment wurde die F1-Einheit auf einer Oberfläche fixiert und an der (in die Lösung ragenden) LaTeX: \gamma-Untereinheit ein fluoreszierendes Aktin-Filament befestigt. Mittels Videomikroskopie wurde gezeigt, dass das Aktinfilament rotiert, wenn die ATP-Synthase aktiv ist [4]. Ein direkter Beweis des Zusammenhangs zwischen ATP-Synthese und der schrittweisen Rotation der F1-Einheit (in 120 \degree Schritten) wurde jedoch erstmals durch die Arbeiten von Dietz et al, erbracht [2]. Es handelt sich um ein besonders schönes Beispiel der Anwendung der FRET-Methode zur dynamischen Messung der Abstände zwischen zwei Komponenten einer biologischen Nano-Maschine. Die Experimente in [2] wurden mit ATP-Synthase von E.coli-Bakterien durchgeführt. Diese wurde in kleine Lipidvesikel eingebaut. Dadurch konnten die biologischen Bedingungen durch Aufbau eines pH-Gradienten über der Membran hergestellt werden. Das Prinzip des Experiments zeigt Abb. 1. Die räumlich fixierte Spange b und der Zapfen LaTeX: \gamma (s. Abb. 30.11 und Abbildung A).wurden mit einem Donor bzw. einem Akzeptor markiert.

Abb 1: Zum Aufbau des Experiments von Dietz et al.[2]. (a) Schemtische Struktur der ATP Synthase. Die Spange (die dem Stator des Rotationsmotors entspricht) wurde mit dem Akzeptor Farbstoff Cyanin Cy5 und der Zapfen mit dem Donor Rhodamin markiert. Die komplizierten molekularbiologischen und chemischen Tricks zur Ankopplung der Chromophoren findet man in Referenzen [2] und [3]. Cy5 ist ein wasserlösliches Molekül. Es absorbiert maximal bei 650nm und fluoresziert im Roten bei 650-670 nm. Rhodamin Farbstoffe absorbieren bei etwa 500nm und fluoreszieren bei 600 nm. In dem Experiment wurde der Donor mit Lichtpulsen von 496 nm angeregt. Die Aufenthaltsdauer der Vesikel im Beobachtungs-Volumen des konfokalen Mikroskops (ca 6 Femtoliter) betrug rund 30 msec. Die Absorptions- und Fluoreszenzspektren sowie eine detaillierte Darstellung der Experimente findet man in [3].


Im Experiment beobachtet man das von den Chromophoren A und D emittierte Fluoreszenzlicht, während des Aufenthalts der Vesikel in dem Beobachtungsvolumen des konfokalen Mikroskops. Dabei wird über Filter die Emission einzelner Donatoren und Akzeptoren separat registriert, zum hochempfindlichen Nachweis der Emission einzelner Moleküle dienen Lawinen-Photodioden (engl. avalanche photodiodes).

Abbildung 2b zeigt typische Zeitverläufe der Emission der Chromophoren D und A unter drei Bedingungen. Im ersten Experiment (das hier nicht gezeigt wird, aber in Figur 3 der Referenz [2] zu finden ist) wurde die Rotation der ATPase mittels Inhibitoren unterdrückt. Im zweiten Experiment Abb. 2.b1 wurde ein pH-Gradient (von LaTeX: \Delta pH \approx 3) zwischen Innen- und Außenraum des Vesikels angelegt und ATP erzeugt. Im dritten Experiment Abb. 2b2 wurde der pH-Gradient entfernt und das Verhalten der ATPase während der Hydrolyse beobachtet.

Gemessen wurde der zeitliche Verlauf der Fluoreszenz von D (grüne Spur) und A (rote Spur), während des Durchtritts der Vesikel durch das beobachtete Volumen. Aus dem Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten LaTeX: F_A und LaTeX: F_D wurde das Verhältnis LaTeX: \eta = \frac{F_D}{F_A} bestimmt, das ein Maß für die Effizienz des Energietransfers ist.

Wie wir in Kapitel 30.7 wissen, rotiert die F1-Domäne während der ATP Synthese und Hydrolyse in entgegen gesetzte Richtungen (s. Abb2a). Schauen wir von F0 in Richtung des F1-Komplexes, so rotiert der Donor während der Synthese im Uhrzeigersinn (UZ) und während der Hydrolyse im Gegenzeigersinn (GUZ). Es gibt drei metastabile Positionen des Zapfens mit dem exzentrisch angeordneten Donor L, M, H, die einen niedrigen (L), einen mittleren (M) und einen hohen Wert der Effizienz LaTeX: \eta liefern (s. Abb.2a). Wie Abb. 2b1 (obere Spur) zeigt, durchläuft im Fall der Hydrolyse die Effizienz LaTeX: \eta die Folge L,H,M,L usw. Im Fall der Synthese (Abb.2b2) beobachtet man eine umgekehrte Reihenfolge H,L,M,H usw.

Abb.2a: Querschnitt durch die ATP-Synthase mit symbolischer Darstellung des Zapfens (LaTeX: \epsilon, \gamma) und der Spange b (dem Stator des Motors). Die exzentrisch zur Rotationsachse gelegene LaTeX: \gamma-Domäne wurde mit dem Donor (D) und die Spange mit dem Akzeptor (A) markiert. (b) Darstellung der Zeitabhängigkeit der Fluoreszenzintensitäten LaTeX: F_D und LaTeX: F_A , sowie des Verhältnisses LaTeX: \frac{F_D}{F_A} nach [2]. Man erkennt, dass im Fall der Hydrolyse (Abb.2.b1) die Effizienz des Transfers zuerst sehr klein ist (L) dann maximal groß wird (H, da D dem Akzeptor am nächsten kommt) und schließlich eine mittleren Wert annimmt (M). Erzeugt man nun einen pH-Gradienten, so dreht sich die Richtung der Rotation um (s. Text) .


Man kann aus den Experimenten noch viele andere Dinge über die molekularen Mechanismen der ATP-Synthase lernen, wie folgende zwei Beispiele zeigen:

1. Aus der Verteilung der Dauer der Zustände H,M,L erhält man die mittleren Verweilzeiten LaTeX: t_V in den metastabilen Zuständen während der Hydrolyse und Synthese. Abb. 3 zeigt das Ergebnis. Man beobachtet exponentielle Verteilungen aus denen die Verweilzeiten in den Zuständen während der Hydrolyse (LaTeX: t_V=19ms) und Synthese (LaTeX: t_V=51ms) bestimmt werden können.

Abb.3: Verteilung der Verweilzeiten in den metastabilen Zuständen L,M,H während der Synthese (LaTeX: t_V= 51ms) und der Hydrolyse (LaTeX: t_V= 19 ms) . Die Verteilungen sind exponentiell, d.h. die Verweilzeiten sind durch Poisson-Verteilungen bestimmt.

2. Der Abstand LaTeX: r_{AD} zwischen D und A in den drei Zuständen kann mit der Förster Theorie unter Anwendung der Gleichung 31.34:

LaTeX: w_{DA}=\frac{W_A}{W_D+W_A}=\frac{1}{1+ (\frac{r_{AD}}{R_0})^6}

bestimmt werden, indem man separate Messungen des Förster Radius in Lösung durchführt. Für das in [2] benutzte AD-Paar ist LaTeX: R_F \approx 64 nm. Der interessierte Leser findet Information darüber in [5].

Referenzen:

1 Junge, W. et al. (2001) Inter-subunit rotation and elastic power transmission in F0F1-ATPase. FEBS Lett. 504: 152 - 160

2 Dietz, M., et al. (2004) Proton-powered subunit rotation in single membrane-bound F0F1-ATP synthase. Nature Struct. Mol. Biol.11 135 - 141.

3 Zimmermann, B., Diez, M., Börsch, M., Gräber, P.(2006) Subunit movements in membrane-integrated EF0F1 during ATP synthesisdetected by single-molecule spectroscopyBiochim. Biophys. Acta 1757 311 - 319

4 Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M., Kinosita, K. Direct observation of the rotation of F1-ATPase. Nature 386: 299 - 302 (1997).

5 Zimmermann, B., (2005) Movements of the LaTeX: \gamma-subunit during catalysis and activation in single membrane-bound H+-ATP synthase. The EMBO Journal 24: 2053 - 2063.

Aufgabe 30.4:

Zur quantitativen Messung der pro Rotation der ATP-Synthase erzeugten ATP.

Das in Aufgabe 30.3 gezeigte Experiment liefert keine quantitative Information über die pro Rotation erzeugte Anzahl von ATP- Molekülen, oder darüber wie viel ATP notwendig sind, um den Motor um 180 Grad zu drehen. Dazu muss man Messungen in sehr kleinen abgeschlossenen Volumina durchführen, um die pro Elementarprozess umgesetzten Zahl an ATP zu bestimmen. In dem Experiment von Rondelez et al. [1] wurde das Problem durch Herstellung sehr kleiner zylinderförmigen Reaktionsräume in Polymermatrizen gelöst (s. Abb. 1a). Die verwendete mikromechanische Methode zur Herstellung findet man in der Orginalarbeit. Genetisch exprimiertes F1 wird mit dem integrierten Zapfen so auf einem transparenten Festkörper fixiert, dass der Zapfen nach oben (d.h. in Richtung des Beobachters) zeigt. An dessen Spitze wird eine magnetische Pinzette fixiert. Belädt man die Mikrokammer mit 500nM ATP so enthält sie etwa 1800 Moleküle, d.h. eine abzählbare Menge. Wir beschreiben unten zwei Experimente.

Abb1: a) Schematische Darstellung des Aufbaus der Messkammer. Diese besteht aus zylindrischen Messkammern (Radius LaTeX: 1.5 \mu m, Höhe LaTeX: 1.1 \mu m, LaTeX: V \approx 5 fL) und ist mit gentechnisch hergestellten F1-Komplexe (d.h. ohne den in der Membran integrierten LaTeX: F_0-Teil) gefüllt. Der Motor wurde mit den LaTeX: \alpha , \beta-Komplexen auf der Oberfläche befestigt. Auf dem nach oben ragenden Zapfen aus den LaTeX: \gamma und LaTeX: \epsilon Fragmenten wurde ein magnetische Pinzette befestigt. Dabei kann es sich um ein superparamgnetische Kolloide handeln. b) Zahl der Rotationen als Funktion der Zeit nach Beladen der Kammer mit 500 nM ATP.

Experiment 1. ATP-Synthase als Motor:

Die Kammer wurde mit 500nM ATP gefüllt (ca 1800 Moleküle) und oben abgeschlossen. Abb. 1b zeigt was beobachtet wird. Die Rotationsgeschwindigkeit nimmt mit der Zeit ab (und zwar exponentiell wie der Einsatz in Abb-1c zeigt). Extrapoliert man die Rotationsgeschwindigkeit gegen LaTeX: v_{rot}=0, so erhält man die maximale Zahl der mit den vorhandenen ATP möglichen Drehungen. Da ursprünglich 1800 ATP vorhanden waren und maximal 500 LaTeX: \pm 100 Drehungen möglich sind werden LaTeX: 3.15 \pm 0.5 ATP pro Umdrehung hydrolysiert. Dies stimmt mit dem Modell gut überein.

Experiment 2: ATP Synthase als ATP-Produzent.

In diesem Experiment ging es darum herauszufinden, wieviel ATP bei der aktiven Drehung der LaTeX: F_0-Domäne erzeugt wird. Dazu wurden die Nanoküvetten mit ca 200 nM ATP gefüllt und deren Drehung im UZ beobachtet. Dann wurde LaTeX: F_0 drei mal mit 10 Hz für 1 min im GUZ gedreht und danach die Geschwindigkeit (bei abgeschaltetem Magnetfeld) während der Hydrolyse bestimmt (s. Einsatz in Abb. 3b). Dabei zeigt sich wieder, dass die Rotationsgeschwindigkeit mit abnehmender ATP abnimmt. Aus diesen Messungen erhielten die Autoren die Zahl der pro Umdrehung erzeugten ATP. In dem Experiment wurde auch gezeigt, dass die Fraktion LaTeX: \epsilon für die Funktion der ATP-Synthese sehr wichtig ist. In Mutanten ohne LaTeX: \epsilon wurden pro erzwungener Umdrehung nur 0,5 ATP erzeugt. Baut man LaTeX: \epsilon wieder, so erhöht sich der Umsatz auf 2.3 ATP pro Umdrehung. Dies zeigt die Bedeutung der LaTeX: \epsilon-Komponente für die Funktion der ATP-Synthase.

Abb. 3: a) Darstellung der drei Stufen des Experiments. b)Messung der Zahl der mit dem rotierenden Magnetfeld erzeugten ATP (Erklärung s. Text).


Referenz:

1 Y. Rondelez et al. (2005) Highly coupled ATP-Synthesis by F1-ATPase single molecules Nature 433: 773-777.